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RNA干扰技术

发布: 2006-11-14 |  作者: 郝海红,卿柳庭,郭定宗 |   来源: 《动物医学进展》

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(华中农业大学动物医学院,湖北武汉 430070)

 

要: RNA干扰现象最初发现于植物中,后来发现此现象广泛存在于几乎所有的真核生物细胞中。它通过一段双链RNA(dsRNA)导致同源mRNA特异性降解从而使目的基因失去表达。在功能基因组学研究中,它是一种可与基因敲除(knockout相媲美的技术;在医学研究中,此项技术可能成为基因治疗的新秀,可广泛用于抗肿瘤,抗病毒和其他一些疾病的治疗中。由于生物体的复杂性和其他原因,RNA干扰技术存在一些问题,这些问题将成为以后研究的新突破点,从而使此技术获得更加广泛的发展。

关键词: RNA干扰;基因治疗

RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术是一种新兴的技术。研究发现它是一种序列特异性的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencingPTGS)机制。此技术因其显著的特点和多方面的功能而应用于基因功能和基因治疗研究等多个领域,成为功能基因组领域和医学领域的又一焦点。

1 RNAi的发现与发展

20世纪20年代,人们发现,植物受到野生型病毒感染后,能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。

1990前,在转基因植物牵牛花(Petunias)的研究中发现,将色素合成基因置于一个强启动子后,导入牵牛花中,试图加深花朵的紫颜色,结果是不仅转入的基因未表达,而且自身色素合成也减弱了。当时将这种现象称为PTGS或“共抑制”(cosuppression) [1]

1992, Ramamor N等在粗糙脉孢菌(Mold neurospora crassa)中导入合成胡萝卜素基因后,约30%的被转化细胞中自身合成胡萝卜素的基因失活,他们称为基因静止(quelling[2]

1995年康乃尔大学的Guo S等用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时,发现正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达,而且两者的作用是相互独立的,机制各异[3]

1998年,华盛顿卡耐基研究院的Fire A等首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默[4],并将这一现象称为RNA干扰RNAi。他们发现双链RNA(dsRNA)能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达,其所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍,且在原核生物中,RNAi具有可遗传性。

1999年短短的一年间,发现RNAi现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物细胞中[5]

2000年,又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RNAi现象。

2001年,RNAi技术被成功地引入到哺乳动物细胞基因功能的研究中[6],使其应用前景更为诱人。

20025月以后,先后出现将RNAi技术应用于抑制艾滋病病毒、丙型肝炎病毒(如美国科学家Mc Caffrey)和癌细胞(如我国徐根兴教授)的研究报道。一些科学家预言,一旦双链RNAi技术能用于临床治疗艾滋病、肝炎和恶性肿瘤,这将是病毒性、寄生病原性、突变基因和癌基因表达等所引起的疾病在基因治疗方面的一场新的革命。

2 机理研究

2.1 RNAi抑制基因表达的基本原理

RNAi是一种序列特异性的转录后PTGS机制[7],由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程,其中需要ATP的参与;它通过一段dsRNA导致同源mRNA降解从而使目的基因失去表达。其基本过程如下。

首先是形成dsRNA。在RNAi技术中,通常是人工合成的特定的dsRNA或通过载体将双链DNA形成小发夹的dsRNA

起始阶段:dsRNA通过细胞膜进入细胞内,在胞浆内的Dicer(是RNA酶Ⅲ家族中的一种序列特异性的核酸内切酶,可以在U处降解dsRNA)的作用下,被分解为21 bp22 bp3′端带有2 nt3 nt末端突出的双链RNA分子,这种小的双链的RNA分子被称为小干扰RNAsmall interference RNAsiRNA)。此小片断RNA具有与对应mRNA足够的序列同源性。

效应阶段:被Dicer加工成的siRNAAgonaute2等一些酶蛋白家族成员结合,形成RNA介导的沉寂复合物 (RNAinduced silenceing complex,RISC)。这种复合物在ATP供能的情况下,将其携带的双链siRNA变成单链siRNA分子,携带了单链siRNARISC就变成了具有活性的RISC。这种具有活性的RISC又被称为Slicer。有活性的RISC同目的mRNA分子结合,如果siRNA的无义链与mRNA不互补,则复合体离开mRNA,若siRNA的无义链与mRNA发生互补交换,则置换出siRNA的有义链,RNAaseⅢ从siRNA的无义链一端切断mRNA,形成25 nt的小分子RNA。这些断裂的RNA小分子,在核酸酶的作用下被降解,从而导致目的基因的沉寂[8]。其中,siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymeraseRdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解。故RNAi一旦启动,就可将对应的mRNA全部降解,达到缺失突变的效应[9]

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