实时荧光定量PCR技术2

发布: 2006-10-09 |  作者: 蒋春燕,王泰健等 |   来源: 《动物医学进展》

上一篇 下一篇

1.5 LUX引物

LUX (light upon extentionLUX)引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术27,使引物同时起到荧光探针的作用。使用LUX引物,不需要专门设计探针,即节省了成本,又给实验设计提供了宽松的条件。由于没有探针控制特异性,因此它的特异性要弱于探针技术,但不受非特异性扩增或引物二聚体影响,所以其特异性要强于SYBR Green ISYBR Green I是一种能与双链DNA 小沟结合发光的荧光染料,没有特异性,不能识别特定的双链,对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光。

以上FQ-PCR探针技术都是根据FRET的原理,因此发生能量转移的两个基团之间的距离要求相当严格。从国内外的实验检测结果来看,上述的各种技术均能够较好的解决这一问题,从探针设计要求和目前国内外的科研及临床应用情况来看,Taq Man TM技术的探针设计较为简单,为广大应用者所选择。

2 FQ-PCR技术的优点及与传统定量方式的区别

2.1 FQ-PCR技术的优点

FQ-PCR的优点可以归纳为:①特异性好,FQ-PCR技术通过引物或和探针的特异性杂交对模板进行鉴别,具有很高的准确性,假阳性低;②灵敏度高,采用灵敏的荧光检测系统对荧光信号进行实时监控;③线性关系好,由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系,通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量,误差小;④操作简单,自动化程度高,FQ-PCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成,不需要开盖,交叉污染和污染环境机会少;⑤没有后处理,不用杂交、电泳、拍照。

2.2 FQ-PCR技术与传统定量方式的区别

传统的定量PCR主要是指倍比稀释法、内参照法、竞争法和PCR-ELISA法等,这些定量PCR技术的不足之处主要在于:难以确定PCR正处于线性扩增范围内(只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例);线性扩增范围确定以后,如何找到一个合适的方法检测结果;大多数是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,重现性差。

FQ-PCR技术是采用始点定量的方式,同时运用高灵敏度的荧光检测系统实时监控每个循环的累积荧光强度,并通过确立Ct值的方法确立样品起始模板数从而实现定量,由线性方程CT = -klgX+ b X指原始模板数)表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。PE公司曾在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增,96条扩增曲线显示随着循环次数的增加重复性变差,而在CT值处PCR产物数量的重现性极好,所以在Ct值处对起始核酸进行定量更具意义,此时误差没被放大,并且此时扩增效率也恒定,处于线性扩增范围内。

2.3 FQ-PCR技术的两种定量形式

2.3.1 绝对定量 FQ-PCR一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量,可以通过化学合成目的基因;或是将PCR扩增产物直接梯度稀释;或是将PCR产物克隆到载体上,然后抽提出质粒,经过测量浓度和拷贝数可准确定量,它的优点是稳定、准确。对于RNA样品,标准品最好是体外转录的RNA,如果用cDNAPCR产物作为标准品,虽然制备简单易于保存,但是将会因为标准品无法准确指示样品反转录效率,而给最终定量起始拷贝数带来影响。

绝对定量也具有相应的缺陷,标准品的稳定保存很难获得成功;目前广泛使用的在260 nm波长下定量的方法与众多因素有关,如水、缓冲液、仪器性能,乃至于核酸的抽提过程都会影响到结果的稳定性。

2.3.2 相对定量 相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因,该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较、反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素,通常选用的管家基因有GAPDH、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA。使用的相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线,根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量,再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。这一方法的缺陷是要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致;此外加入已知起始拷贝数的内标相当于是进行双重PCR反应,存在两种模板相互的干扰和竞争。

在实验生物学及临床医学的一些场合,由单纯PCR所提供的阳性或阴性结果还远远不够,在阐述许多问题的本质时,基因及其表达的定量起着至关重要的作用。绝对定量和相对定量都有各自的优缺点,所以需根据具体的实验需要选择采用合适的定量方式,从而得到更准确的实验结果。

3 提高FQ-PCR技术检测方法的特异性和灵敏度

3.1 探针及引物的设计要求

理论上,只要设计的引物对目的基因有足够的特异性就能保证荧光定量PCR检测方法的特异性和灵敏度,但实验过程中影响FQ-PCR特异性敏感性的因素众多,除了一般PCR反应均存在的影响因素如反应体系、Taq酶的活性、引物二聚体之外, FQ-PCR还有其特殊的影响因素,如反应体系中形成的引物-探针二聚体产生的影响,可以使用热启动办法消除也可以尽可能地优化引物探针的设计,如设计时两条引物不能互补(尤其在3′端)、使两条引物的GC含量大致一致、将探针3′末端完全磷酸化使之不能延伸、使用纯化的引物探针进行实验等。在Taq Man TM探针设计时还应避免重复出现相同的核苷酸,特别是连续出现≥4G的情况;探针的5’端的第1个碱基避免是G;探针序列中碱基C的含量应高于G的含量;引物与探针要尽量靠近但不能重叠,上游引物的3′和探针的5′之间的距离在1 bp15 bp之内。

3.2 Mg2+、引物和探针的浓度

Mg2的浓度将影响到FQ-PCR的敏感性。首先,Mg2是影响Taq酶活性的关键因素,如果Mg2+的浓度无法使Taq酶发挥最佳活性,无疑将会影响到实时定量的敏感性;其次,Mg2的浓度过高,会增加引物二聚体的形成,从而导致敏感性降低。一般来说,对以DNAcDNA为模板的PCR反应,应选择2 mmol/L~5 mmol/L浓度的MgCl2,对以mRNA为模板的RT-PCR而言,则应选择的浓度为4 mmol/L~8 mmol/L。引物和探针的浓度也会影响反应的特异性,较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。最佳的引物浓度一般在0.1 μmol/L0.6 μmol/L,探针的浓度在0.05 μmol/L0.3 μmol/L之间,可以在这个基础上再进一步优化,以达到引物探针整体的最佳浓度。

3.3 循环数

PCR扩增效率理论上为100%,PCR产物随循环的进行成指数增长,通常扩增效率≤1,并在整个PCR扩增过程中不是固定不变的,循环次数n30时,扩增效率相对稳定,原始模板以相对固定的指数形式增加,适合定量分析,这也就是通常所说的指数期,在实验中一般将CT值大于30的样品重新检测以排除假阳性的可能。但是对于那些极微量的待测样本而言,适当增加循环数可以提高反应的检出底限,循环数建议为40,但是并非循环数增加的越多,其敏感性就会越高,实际上,当循环数增加到某一值时,敏感性便不再升高。

4 结语

FQ-PCR技术克服了传统检测技术由于样品病原体含量较低带来的检测难度,通过设计针对目的基因的特异性引物和探针,并优化反应体系和反应循环参数可成功地建立快速、灵敏、特异的FQ-PCR检测方法,可实现大样本同时检测,并节省大量试验时间和反应成本,为基因定量检测和准确定量疾病相关基因的表达提供了有效的技术手段,同时实现对人类和动物疾病的早期诊断与基因分期、分型,以及对人类肿瘤转移的早期发现及预后判断,因此FQ-PCR技术在临床上将有更加广阔的应用前景

 

TAG: 检测 标准
上一篇 下一篇