实时荧光定量PCR技术

发布: 2006-10-09 |  作者: 蒋春燕,王泰健等 |   来源: 《动物医学进展》

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(中国兽医药品监察所,北京 100081)

 

要:荧光定量PCR技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的,具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单等优点,不但能够用于基因定量检测,还能准确定量疾病相关基因的表达,现已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、定量分析、早期诊断、基因分型等方面。它可以采用绝对定量和相对定量2种方式实现定量检测,但都有各自的优缺点,需根据具体的试验选择合适的定量方式,从而得到更准确的试验结果。提高荧光定量PCR技术的特异性和灵敏度需从多方面着手,主要指特异性探针及引物的设计,选择合适的Mg2浓度、引物和探针浓度、循环数等。

关键词:荧光定量PCR;基因定量;检测技术

随着基因诊断技术的不断发展和成熟,基因诊断在临床中的地位显得更为重要。自从1983Mullis发明聚合酶链式反应(polymerase chain  reaction PCR)以来,PCR技术作为一种重要的基因诊断方法,以其迅速、简便、灵敏等优点很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统PCR技术在应用中遇到了一些难题,一是不能准确定量,二是容易交叉污染,产生假阳性。为克服上述不足,人们采取了许多方法,如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降解法等,但均不能得到满意的结果,直到近年来荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transferFRET)技术用于PCR定量后,上述问题才得到较好的解决。1992Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析,为解决传统PCR的难题提出了新的思路。文章旨在介绍目前国内外几种实时荧光定量PCRreal-time fluorogenetic quantitative PCRFQ-PCR)技术的原理及主要应用现状。

1 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR包括探针类和染料类两种,探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加,染料类如SYBR Green I 则是利用与双链DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤,特异性更高;但后者则简便易行,成本较低。下面着重介绍荧光探针技术。

荧光探针技术是基于标记基团的FRET原理而实现的,当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠,且两个基团距离足够近时,能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团,相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽,这个过程称为FRET。按其基团标记和能量转移的方式,目前已经开发出几种相关的技术,如Taq Man TM探针、双杂交探针、分子信标、Amplisensor LUX TM Primers等。

1.1 Taq Man TM技术

1.1.1 Taq  Man TM技术的工作原理  Taq Man TM技术是由美国Perkin ElmerPE)公司研制的一种实时PCR技术,它在一条20bp的寡核苷酸探针的两端分别标记上荧光发射基团(R)和淬灭基团(Q),在PCR反应中设立标准品模板系列和阴性对照,根据FRET原理,探针完整时发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;当PCR扩增时,Taq酶的5-3′外切酶活性将探针酶切降解,使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个游离的荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步,并计算出Rn值、△Rn值、Ct值和阈值。Ct值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环数。同时利用标准品模板系列绘制出标准曲线,结合各样品的Ct值,就可以确定样品的起初模板量。常用的荧光基团是FAMTETVICHEX

1.1.2 Taq  Man TM技术的应用现状和前景

(1)Taq Man TM 技术在人类传染病诊断和肿瘤研究上的应用。Taq ManTM  FQ-PCR技术具有简便、灵敏、准确等优点,目前已经在人类传染病诊断和病原定量上得到了应用,如乙肝病毒[1]、丙肝病毒[2-3]、艾滋病病毒4EB病毒5SARS冠状病毒[6]和遗传性疾病等的诊断治疗中得到了广泛的应用,并开发出了转基因动植物基因检测荧光PCR试剂盒系列和进出口检验检疫荧光PCR试剂盒系列,建立的实时荧光定量PCRFQ-PCR)较常规检测方法具有较好的灵敏度和特异性,通过定量测得其病原体含量与患者的病情变化及严重程度有一定的相关性,对临床诊断和疗效观察有重要的指导意义。

Taq  Man TM FQ-PCR在人类肿瘤研究上的应用还处在研究和开发阶段,随着分子生物学的迅猛发展,肿瘤研究领域的大量研究成果显示,肿瘤的发生、发展、治疗和预后与肿瘤细胞内部基因和肿瘤相关病毒有关,在应用于血液系统肿瘤[7],胃癌[8]患者相关检测中显示,该方法具较高的敏感性,对预后和诊断是有力的指标,最近又有文献报道将FQ-PCR技术应用到头颈肿瘤[9]、口腔肿瘤[10]、淋巴瘤[11]等肿瘤中,得到了较好的检测结果。

(2)Taq  Man TM技术在动物疾病诊断上的应用。Taq  Man TM  FQ-PCR技术在动物疾病病原体基因的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定上都有较为广泛的应用,国内外[12-15]都有相关报道。通过RT-PCR检测口、鼻、泄殖腔等分泌物拭子16对早期诊断、有效预防和控制动物疫情的暴发具重要意义;赖平安等[17]建立了快速通用型“一步法”检测活禽和禽产品中所有A型禽流感病毒的FQ-PCR检测技术,花群义等[18]采用FQ-PCR对水疱性口炎病毒(VSV)的鉴定检测,都为畜禽疫病的检疫、动物性食品安全检验提供了一种新方法。

(3)Taq  Man TM技术在疫苗效力测定上的应用前景。效力检定是检测疫苗有效性的重要环节,其目的在于了解制品是否能够达到预期的效果。由于疫苗制品的检定一般多采用生物学方法测定,因此在检定中就难免会出现检定结果准确性不佳,究其原因与动物试验过程中的各种因素相关,这些因素包括:试验动物的个体差异,如种属、种系、性别、年龄、生理及临床表现;环境因素、饲养管理条件及营养状况;所用试剂和原材料的纯度或敏感性不一致、试验程序的差异等。FQ-PCR技术有望替代动物试验建立测定疫苗效力的方法,并通过大量的重复性试验和多种技术的符合性试验,确定FQ-PCR和动物试验之间以及与疫苗病毒粒子之间的平行关系并最终确定FQ-PCR法与疫苗效价之间的相互关系,提高疫苗成品和半成品的检定工作质量。

1.2 双杂交探针

双杂交探针是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术,也是依赖于FRET原理进行的。该技术的特点是将荧光基团和淬灭基团分别标记在发光探针的5′端和淬灭探针的3′端两个不同的探针上,两探针可与模板同一条链相邻的序列杂交,杂交时两探针的荧光基团和淬灭基团便紧密相邻(1个~5个碱基),从而发生FRET而使荧光淬灭,荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比,以此可以进行PCR定量分析。

该方法的特点是淬灭效率高,但由于两个探针结合于模板上,因此影响扩增效率;此外,由于需要合成两个较长的探针,合成成本相对较高,常用的荧光基团是LC-Red640LC-Red705。双杂交探针技术同样可用于病原体检测[19]、病毒荷载量[20]的测定等领域。

1.3 分子信标技术

分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,环形部分的碱基可与目标核苷酸序列互补,一般为15~30个核苷酸长;茎部是由互相配对的碱基组成,不能与目标基因相配对结合,一般5~7个核苷酸长;在3′和5′端分别接上发光基团和淬灭基团,当溶液中有特异模板时分子信标与模板杂交,从而破坏了发卡结构即实现了FRET,释放出荧光信号,荧光的强度与溶液中分子信标的量成正比,从而实现了对目的基因的定量检测。常用的荧光基团有FAMTexas Red

目前,分子信标技术已应用于基因定量分析、疾病基因检测与诊断21、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析等生物医学基础和临床研究,如姜晓峰等22将毛细管电泳技术和分子信标技术结合,用于胃癌患者的癌组织及癌旁组织DNA p16基因检测。

1.4 Amplisensor

这是美国Biotrnics Tech 公司推出的荧光定量PCR检测系统,其基本原理也是FRET。先进行一次不对称扩增;第2轮扩增时, 在双链信号引物的两条互补链上, 分别标记荧光供体和受体,当信号引物处于双链结构时产生荧光。在PCR 过程中, 变性使引物荧光基团分离, 复性时引物将优先与不对称扩增产物结合, 使引物不再产生荧光。Amplisensor 检测系统采用半套式扩增和双链引物, 特异性高, 灵敏度与竞争性PCR 相似, 检测范围可达1031011。现已应用于乙型肝炎病毒DNA23、结核性脑膜炎24、外周血中结核分支杆菌DNA25、肺外结核26的定量分析,对诊断和判断病毒是否复制、复制程度及病情变化提供可靠依据。

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