新型鸭肝炎病毒流行病学调查及免疫防治试验

发布: 2010-04-03 |  作者: 刘建,苏敬良等 |   来源: 《中兽医医药杂志》|中国农业大学动物医学院,北京 海淀

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 (鸭肝炎(DH)是雏的一种传播迅速的高度致死性病毒病,以肝炎为其主要特征。病原分别是1型、2型和3型鸭肝炎病毒(DHV)。人们首次认识到2型和3型DHV作为独立的病原体,是由于免疫了1型的雏鸭仍可罹患肝炎。我国商品肉鸭早在1960年即有临床病例报

道,1980年潘文石等在北京首先分离到鸭肝炎病毒,郭玉璞等于1984年确定为1型DHV。该病在我国广大养鸭地区均有不同程度的流行, 由于其致死率高,一旦暴发,往往给养殖业造成很大的经济损失,是商品肉鸭的主要传染病之一。随着弱毒疫苗和高免卵黄抗体的应用,1型DHV感染得到一定的控制,但在1999年之后许多养鸭地区发生一种临床表现和剖检病变与1型DHV感染相似的病例,用弱毒疫苗和卵黄抗体预防和治疗无效,怀疑为1型变异株和新的血清型。苏敬良等经过病原分离和血清中和试验,证明在北京和广西存在有新的血清型毒株。为了进一步了解该病的流行情况,制定相应的防治措施,本研究采集了部分地区疑似鸭肝炎的病料进行病毒分离、血清中和试验和弱毒株免疫保护试验,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 参照毒株 1型DHV弱毒株、新型DHV G株和B株,本实验室保存。

1.2 实验动物 免疫用SPF鸡 中国农业大学实验动物所提供;日龄北京鸭,购自中国农科院畜牧所;北京鸭胚,购自中国农科院畜牧所;繁殖1型DHV所用鸡胚,购自中国农业大学试验鸡厂。

1.3 鸭肝炎病毒毒株的分离

1.3.1 病料来源 根据各地送检雏鸭,剖检有明显的肝脏出血病变,然后取肝脏进行病毒分离,各分离株来源如下:J株,北京某鸭场;R株和RL株,河北任丘2个鸭场;F株和SL株,山东2个鸭场;L株,2001年山东昌乐某鸭场;H株和HY株,河北河间两鸭场;GX株,广西兽医研究所分离。

1.3.2 病料处理 将肝组织剪碎后按1∶5加灭菌PBS,置于组织研磨器中研磨,8 000r/min离心20 min,取上清,220 nm滤器过滤,滤液作为接种材料。

1.3.3 鸭胚接种与传代 将病毒液经尿囊腔接种10~12日龄鸭胚,每枚鸭胚注射0.2 ml,每

个样品接种3~5枚鸭胚,37℃孵育,弃掉24 h内死亡鸭胚,收获96 h内死亡尿囊液。第一代若在96 h内未死亡,则4℃冻死,收集尿囊液,盲传1代,第二代仍未死亡者弃去。选择可致死鸭胚,经细菌培养无污染的尿囊液,在鸭胚中继续传至第5代,收集尿囊液,-80℃保存备用。

1.3.4 分离株人工感染试验 1日龄雏鸭笼养至6日龄,腿静脉注射感染分离株鸭胚尿囊液毒,0.3 ml/只,观察记录结果。

1.4 病毒分离株的鉴定

1.4.1 SPF鸡抗DHV血清的制备(1)鸡抗1型DHV血清制备:将实验室保存的1型DHV弱毒接种10日龄鸡胚,37℃孵育,收集24~96 h内死胚尿囊液,并测定该毒株的毒价,-20℃保存备用。取上述收集的1型DHV弱毒鸡胚尿囊液毒肌肉注射3只35日龄SPF鸡,1免1.5 ml/只,2免每只2 ml,3免每只2.5 ml,每次免疫时间间隔10天。3免后15天心脏采血分离血清,-20℃保存备用。(2)鸡抗新型DHV血清制备:将实验室保存新型DHV G株接种10日龄鸭胚,37℃孵育,收集24~96 h内死胚尿囊液,并测定该毒株的毒价,-20℃保存备用。取上述收集的新型DHV G株鸭胚尿囊液毒免疫35日龄SPF鸡,免疫方法同上。

1.4.2 各分离株鸭胚半数致死量(ELD50)的测定 根据ReedMuench法计算各毒株的ELD50。1.4.3 鸭肝炎病毒中和试验 (1)鸡抗DHV血清中和效价测定:用固定病毒稀释血清法对1型和新型DHV血清做中和试验。(2)使用上述固定病毒稀释血清法对12株分离株做中和试验。

1.5 新型DHV免疫保护试验

1.5.1 B株传代致弱试验 将本室分离保存的新型DHV B株经鸭胚尿囊腔传代传至第20代,命名为B20株,测定其尿囊液毒ELD50为10-4.35/0.2 ml。

1.5.2 攻毒用强毒株毒力复壮 取新型DHV G株第5代尿囊液毒肌肉注射5日龄雏鸭,每只0.5 ml。取死亡雏鸭肝脏,研磨并加抗生素除菌后,再接种5日龄雏鸭,连续返强3代可100%致死雏鸭后,取死亡雏鸭肝脏作为攻毒时所用种毒,并用鸭胚测定该种毒的病毒滴度。1.5.3 肝组织强毒ELD50测定 将肝组织充分研碎,取1 ml浸出液,加入5 ml灭菌PBS和4 ml双抗溶液,4℃过夜除菌。将处理过的肝组织毒根据ReedMuench法计算毒株的ELD50。1.5.4 雏鸭的免疫 将1日龄雏鸭分为A、B、C、D和E共5组,A组免疫1型DHV弱毒株

(鸡胚尿囊液毒20倍稀释),B、C、D组分别免疫新型DHV B20株20倍稀释、50倍稀释和100倍稀释的鸭胚尿囊液毒。免疫组B、C、D组免疫15只雏鸭,每只0.5 ml,A组免疫10只雏鸭,每只0.5 ml。E组10只为未免疫对照组。

1.5.5 攻毒保护试验 在雏鸭10日龄时,用上述新型DHV返强毒攻毒,每组攻10只,腿部肌肉注射,每只0.5 ml,观察记录死亡情况。

1.5.6 免疫组鸭血清抗体效价测定 (1)B、C、D组各采集5份血清,分别于免疫后5天、10天、16天和21天采血,10 000 r/min离心3~5 min分离血清。所收集血清于56℃水浴灭活30min,过滤除菌。(2)用固定新型DHV G株病毒稀释血清法做中和试验,并计算血清中和效价。

2 结果

2.1 病毒的分离 从9份疑似肝炎的病料中,经鸭胚尿囊腔途径接种10~12日龄鸭胚,分离得到9株病毒。这9株病毒经过鸭胚传至第3代可100%致死胚,死亡胚体表现为出血、水肿,部分肝脏有明显的坏死灶或坏死点。

2.2 病毒分离株人工感染雏鸭结果 对8个分离株的第3代鸭胚尿囊液毒,经腿静脉接种感

6日龄雏鸭,各毒株对雏鸭的致死率为0~100%不等,死亡情况见表1。雏鸭死亡绝大部分发生在感染后48 h以内,主要表现为短时间内停止运动,蹲伏并半闭眼。病鸭身体倒卧,两腿痉挛性后伸,头向后背,一般在出现症状后1~2 h左右死亡。剖检死鸭可见明显的肝脏肿大、出血,肝脏表面有出血点,部分死亡雏鸭可见肾脏有充血和出血,少部分雏鸭脾脏见有针尖大小的坏死点。

1 8个分离株人工感染6日龄北京鸭的死亡情况

毒株名称 雏鸭数           死亡情况                              死亡率(%)

24 h    36 h   48 h  60 h   124 h  132 h

SL         5                                                         0

H          5    4                                                    80

L          5            2                                            40

F          5                                 1                       20

R          5    2       1                           1                80

RL         4    3       1                                            100

GX         5    1       3                                            80

J          5            2                                            40

 

2.3 标准毒株毒价测定及SPF鸡抗血清中和效价测定 对1型DHV弱毒和新型DHV G株分别采用鸡胚和鸭胚测定两株毒株尿囊液毒的毒价,结果1型DHV弱毒株的ELD50=10-4.83/0.2 ml。新型DHV广西分离株鸭胚ELD50=10-4.22/0.2 ml。

SPF鸡经过三免后制备出抗1型弱毒株和新型DHV广西分离株血清,与1型DHV弱毒和新型DHV病毒中和效价见表2。

2 SPF鸡抗1型和新型DHV抗体血清中和效价

鸡抗1型DHV血清稀释倍数   鸡抗新型DHV血清稀释倍数    病毒对照组

20× 40× 80× 160×     20× 40× 80× 160×

1型DHV死胚数      0    0    1     2        5     5    5     5           5

新型DHV死胚数      5    5    5     5        0     0    1     3           5

由表2可知,1型和新型DHV两毒株之间无血清交叉反应,两种血清在40倍稀释时能100%中和同源病毒,因此我们将2种血清作40倍稀释作为本试验的阳性血清工作浓度。

2.4 病毒分离株鸭胚ELD50的测定 对所分离9株病毒传至第5代,收集鸭胚尿囊液毒,测定ELD50,为10-3.5~10-7.32/0.2 ml。

2.5 各分离毒与1型和新型DHV抗血清中和试验结果 11型和新型DHV抗血清做不同稀释倍数后,分别与12个毒株的200个ELD50的稀释液中和得出分离株中和结果,各毒株各稀释度接种5枚鸭胚,同时设有5枚对照。

3 分离株血清分型结果

毒株 不同稀释倍数1型DHV血清中和死胚数 不同稀释倍数新型DHV血清中和死胚数对照组死胚数血清型判定

20× 40× 80×                        20× 40× 80×

HY      5   5     5                          1     0     0                   5       新型DHV

R       5   5     5                          1     0     1                   5       新型DHV

F       5   5     5                          0     0     1                   5       新型DHV

GX      5   5     5                          0     1     1                   5       新型DHV

L       5   5     5                          1     0     0                   5       新型DHV

H       5   5     5                          0     0     0                   5       新型DHV

RL      5   5     5                          0     1     1                   5       新型DHV

SL      1   0     0                          5     5     5                   5       1型DHV

J       0   1     1                          5     5     5                   5       1型DHV由表3可知,HY、R、F、G、L、H、和RL这7株可被新型DHV血清中和,判定为新型鸭肝炎毒株;ST和J这2株可被1型DHV血清中和,判定为1型鸭肝炎毒株。

2.6 新型DHV免疫保护试验结果

2.6.1 强毒株毒力复壮结果 新型DHV广西株第5代尿囊液毒肌肉注射感染5日龄雏鸭后第1代致死率为75%(3/4),取死亡鸭肝脏处理后再感染雏鸭,死亡率可达到100%,而且雏鸭死亡集中于48 h以内,最快的在接种后20 h左右死亡,剖检肝脏有明显的肿胀和出血。收集复壮第3代死亡鸭肝脏均做无菌处理,测定肝组织含毒量,根据ReedMuench法计算出ELD50=10-6.37/0.2 ml。

2.6.2 雏鸭攻毒实验结果〓将新型DHV B20尿囊液毒和1型DHV弱毒免疫1日龄雏鸭后,从临床上观察未出现任何不良反应,采食和精神状态等与对照组相比未见有任何异常,说明新型DHV B株经过鸭胚传代后,毒力被致弱。免疫后10天,采用新型DHV复壮毒进行攻毒保护试验,结果如表4。

 

4 1型DHV弱毒及新型DHV B20免疫雏鸭后对新型DHV强毒攻毒保护试验结果

免疫所用弱毒株        攻毒雏鸭数                  死亡情况             死亡率(%)

24 h  48 h 72 h  96 h  124 h         

1型DHV弱毒株(20×)    10        8                        1             90

B20弱毒株(20×)         10        0                        0              0

B20弱毒株(50×)         10        2    2                   0             40

B20弱毒株(100×)        10        3    4      3            0            100

未免疫对照组             10        10                                    100

由表4可知未免疫对照组100%死亡(10/10),1型DHV弱毒株免疫组死亡率为90%(9/10),B20尿囊液毒20倍稀释后对攻毒保护达100%,50倍稀释保护率为60%,100倍稀释无保护作用。根据这一结果可以认为B株病毒经过鸭胚传代后对雏鸭无明显的致病性,但仍有一定的免疫原性,可以作为新型鸭肝炎的疫苗候选株。

2.6.3 免疫组鸭血清中和抗体效价测定结果 采用新型DHV B20尿囊液毒的不同稀释倍数免疫1日龄雏鸭后,在不同日期对免疫组雏鸭采取血样,通过鸭胚中和试验结果可以看出,雏鸭接种弱毒后很快可刺激机体产生中和抗体。B20弱毒株20倍稀释接种后5天平均抗体效价为1∶45,之后继续上升,第10天检测时达到高峰,为1∶56。然后呈下降趋势,至21日龄时抗体效价为1∶29。B20弱毒株50倍稀释接种后5天平均抗体效价达1∶28,之后继续上升,第10天检测时达到高峰,为1∶45。然后呈下降趋势,至21日龄时抗体效价为1∶31。B20弱毒株100倍稀释接种后5天平均抗体效价为1∶29,然后呈下降趋势,至21日龄时抗体效价为1∶22。根据所测血清的中和效价,不同稀释度毒株免疫后,抗体产生动态见图1。

1 B20尿囊液毒不同稀释倍数免疫鸭血清抗体产生动态图(略)

3 讨论 

3.1 关于鸭肝炎病毒的分离和流行病学 本试验所采集的病料来源于北京、河北、山东和广西等地区的鸭场,选择临床症状和病理剖检变化疑似病毒性肝炎的病死鸭肝脏组织作为分离对象。病料经过无菌处理后经尿囊腔途径接种10~12日龄鸭胚,从第一代开始即可致死鸭胚,传至第3代,所有分离株均可100%致死鸭胚。将分离株人工感染7日龄雏鸭,死亡率为0~80%,死亡鸭表现出明显的肝炎剖检病变。从血清中和试验结果看出,9个分离株中,有7个属于新的血清型,而且新型鸭肝炎分离株对雏鸭均有明显的致病性;2个分离株为1型。这一结果说明我国部分地区存在有新型鸭肝炎病毒流行,也解释了某些鸭场雏鸭在免疫接种了1型肝炎弱毒疫苗后仍然发生肝炎。

3.2 关于新型鸭肝炎病毒的免疫预防 本研究中选用了早期分离的致病性较低的新型鸭肝炎病毒B株经过鸭胚连续传20代后,初步试验证明对雏鸭无致病性。以其鸭胚尿囊液毒试验免疫接种雏鸭,攻毒保护试验表明对新型鸭肝炎病毒的强毒有很好的保护作用。20倍稀释时,保护率达到100%,而随着稀释倍数的增大,保护率下降。免疫了1型DHV弱毒株的雏鸭和未免疫的雏鸭于24 h左右死亡。通过鸭胚中和试验测定免疫鸭血清的中和效价,雏鸭在免疫后5天即可检测到中和抗体,免疫后10天抗体水平达到最高,随着免疫日龄的延长,抗体水平逐渐下降。而当弱毒株稀释倍数为100倍时,抗体水平比较低,这可能与尿囊液毒价相对较低有一定的关系。

从本试验的结果可以看出,无论是体外试验还是体内攻毒保护试验,新型鸭肝炎病毒与1型鸭肝炎病毒都无血清学交叉反应。鉴于该病在我国部分养鸭地区的流行情况,研制新型鸭肝炎病毒弱毒疫苗对该病的预防具有一定的实际意义。B株弱毒株在经鸭胚传代致弱后,仍然有一定的免疫原性,在一定的稀释倍数内可以刺激免疫体产生抗体而起到保护作用,可以作为疫苗的候选株。

 

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