菌痢康体外抗鸭大肠杆菌后效应初探

发布: 2010-04-03 |  作者: 刘娟,朱兆荣等 |   来源: 《中国兽医杂志》|山东省沂水县畜牧局

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                         (西南大学动物科技学院, 重庆 荣昌 402460) 

近年来,对抗生素后效应Postantibiotic Effect,PAE)的研究逐渐受到国内外学者的重视,其研究不断深入,发现几乎所有的药物都具有PAE。目前许多国家已将PAE作为评价抗生素抗菌药效的重要参数和设计临床给药方案的重要依据。抗生素后效应系指细菌与抗生素短暂接触,当清除药物后,细菌的生长仍受到持续抑制的现象。PAE改变了人们长期以来认为的抗生素必须达到并且维持有效血液浓度才能发挥作用的观念,加强了人们关于药物对细菌繁殖规律影响的认识。大肠杆菌是兽医临床上畜禽常见致病菌,危害性很大,严重影响了畜禽业的发展。而由白头翁、连翘、黄芩、柴胡(具备清热解毒,消炎抑菌等作用),提取液与盐酸环丙沙星组成的复方制剂——菌利康临床应用效果较好。我们对其PAE进行研究,以期进一步优化临床给药方案的设计,减少抗生素给药剂量,延长给药时间间隔,减少不良反应,同时也能保证药物的抗菌效果,充分发挥药效。

 

1    材料与方法 

1.1   材料

1.1.1 试验药品 菌痢康:由中药与盐酸环丙沙星粉按一定比例配制;盐酸环丙沙星粉:河南省大名实业有限责任公司动物药品厂生产;中药:白头翁、连翘、黄芩、柴胡,购于重庆市荣昌县中药公司批发部;氯化钠、氢氧化钠、氯化钡、硫酸等试剂均为化学纯或分析纯。

1.1.2  受试菌株和培养基  鸭型大肠杆菌:由西南农业大学动物科技学院微生物教研室提供。牛肉膏(北京博星生物技术有限公司)、琼脂(青岛水产品加工厂)、蛋白胨(广东省汕头市生物化学制药厂)。麦康凯琼脂培养基、普通肉汤培养基,按微生物学制备培养基原则方法配制。

1.1.3  药液和培养基的配置

1)准确称取盐酸环丙沙星粉2.0 g加入100 ml棕色容量瓶中,用超滤水溶解、定容,使药液浓度为20 μg/ml,此为贮存液。置于-20℃冰箱中保存。临用前用无菌生理盐水稀释成所需浓度的应用液,灭菌后置于4℃冰箱中备用。

2)肉汤培养液:取蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g、牛肉膏10.0 g,加蒸馏水1 000 ml,

加热溶解后用0.1%氢氧化钠溶液调节pH为7.2~7.6,冷却后过滤,高压灭菌,备用。

3)麦康凯琼脂培养基:取麦康凯琼脂原粉51.0 g,加蒸馏水1 000 ml,加热溶解后贮存在烧瓶中,高压灭菌,备用。

 

1.2   方法

1.2.1 药物最小抑菌浓度的测定

1.2.1.1 采用二倍稀释法测定三种药物的最小抑菌浓度(MIC)

(1)取灭菌的试管10支,于每管中先加入无菌肉汤培养基2.0 ml,然后于第1支试管中加入灭菌的受试药液(不同浓度的菌利康和环丙沙星)2.0 ml,混匀后取出2.0 ml放入第2试管中,依次类推,直到第9管取出2.0ml弃去,使之成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16……等各种浓度,第10管不加药物作为对照管,以便观察培养基是否适合细菌的生长。第11管中加受试药剂2.0 ml,混匀后取出2.0 ml弃去,不加细菌以便观察受试药物是否污染。

(2)将肉汤培养6~8 h的实验菌液用无菌肉汤稀释成10-3浓度,取0.1 ml分别加入上述1~10管中,混匀后一起放入37℃的恒温箱中培育16~24 h观察结果。若肉汤浑浊,表示细菌生长;若肉汤不浑浊,表示细菌无生长。

(3)未生长细菌管内的肉汤转种到肉汤琼脂培养基上,若仍无细菌生长,即表示该药量就是

受试药物的最低抑菌浓度。

1.2.1.2  杯管法测定3种药物的最小抑菌浓度(MIC)

(1)取受试药液2.0 ml于一试管中,然后用蒸馏水依次将其浓度稀释成1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512。

(2)先在无菌平面皿上加入已熔化的2%麦康凯琼脂培养基10.0 ml作为底层,待凝固后在加入含有培养18~24 h实验菌液的麦康凯琼脂培养基5.0 ml,铺于上述底层之上。凝固后,在培养基上放置牛津杯(无菌不锈钢,内径6.0 mm,外径7.8 mm,高10.0 mm)4个,于牛津杯中加满受试药液后置于37℃的恒温箱中培养8~12 h,观察抑菌圈的大小。

1.2.2  PAE的测定

1)取待测菌1~2个单菌落接种于2 ml MH肉汤培养基中,37℃振荡孵育16~18 h,以麦氏比浊管校正其浊度,使其浊度为108 cfu/ml,再用预温新鲜MH肉汤稀释100倍,使其浊度为106 cfu/ml。

(2)诱导PAE:先配制5 MIC、20 MIC的盐酸环丙沙星溶液,再分别取不同浓度的盐酸环丙沙星溶液0.2 ml与1.8 ml浊度为106 cfu/ml的细菌悬液混匀,放置于15 ml的试管中作试验管,第3管中加入0.2 ml无菌生理盐水和1.8 ml的细菌悬液作为对照管,各管混匀后立即放入37℃恒温箱中保存,使菌液与药液接触2 h,各管药物浓度分别为0.5 MIC、2.0 MIC、0 MIC。

(3)去除药物与重建:采用100倍稀释去除抗菌药物,然后取上述各试管药物和细菌混合物及

对照管中的菌液分别加入37℃预温的新鲜MH肉汤中重建,置于37℃恒温箱中孵育,此时为重建后的零时。

(4)细菌重建后恢复生长动力学曲线的建立:于重建后0、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h,8 h分别取菌液0.1 ml作系列稀释,于琼脂平板上进行菌落记数,测出cfu/ml值,重复3次,取平均值。将细菌计数所得的各时间点cfu/ml值取常用对数(log10),以其为纵坐标,以孵育时间为横坐标作图,建立试验菌与对照菌重建后恢复生长的动力学曲线。

(5)PAE时间的计算:由细菌生长的动力学曲线计算出T值(试验组细菌的cfu/ml值高于重建后零时10倍(1log10 cfu/ml)所需时间)和C值(对照组细菌的cfu/ml值高于重建后零时10倍(1log 10 cfu/ml)所需时间,按公式PAE=T-C计算PAE时间。

 

2 结果

2.1 抗菌活性的测定 试验结果表明, 菌利康和盐酸环丙沙星均具有较强的体外抗菌活性, 二者对大肠杆菌的最低抑菌浓度分别是0.313和0.284 μg/ml。

2.2  体外PAE的测定  结果表明PAE的值有浓度依赖性,菌利康和盐酸环丙沙星在0.5~2.0 MIC剂量范围内均对大肠杆菌显示出不同程度的PAE,并且同种药物的PAE值与药物接触浓度呈正相关,随药物接触浓度的增大,PAE均有增大的趋势,但程度不同。由试验结果可知,菌利康在体外对大肠杆菌的PAE强于盐酸环丙沙星,详见表1。以活菌数cfu/ml的对数为纵坐标,以孵育时间为横坐标,绘制细菌生长曲线,去除药物后的细菌恢复生长情况亦可以看出,药物的浓度越大,对细菌生长繁殖的抑制作用越强,除去药物后,细菌的生长情况恢复缓慢。其中同在药液MIC时,菌利康使大肠杆菌恢复的速度较慢,而在最初一段时间内强度则较大,这表明菌利康的抑菌时间长于纯盐酸环丙沙星,详见图1、图2。

 

1  体外PAE结果(略)

1  菌利康对大肠杆菌的生长抑制恢复曲线图(略)

2  盐酸环丙沙星对大肠杆菌的生长抑制恢复曲线图(略)

 

3 分析与讨论

3.1 抗菌药后效应系指细菌与抗生素短暂接触后,将药物完全除去,细菌的生长仍然受到抑制的效应。随着人们对PAE认识的不断深入,逐渐改变了人们对传统抗生素应用的观念,为临床确定恰当的给药方案提供了依据。由于PAE反映了抗生素清除后或大大低于MIC时细菌的生长仍然受到抑制,故可充分利用PAE的特点来指导临床合理用药,在不影响药效的同时,不仅可以减少药物用量,还可以减少药物的不良反应和经济费用。

3.2  菌利康和环丙沙星均对大肠杆菌具有明显的PAE。试验结果表明,菌利康和盐酸环丙沙星均对大肠杆菌具有明显的PAE,且具药物浓度依赖性,即药物浓度越大,PAE越大。这与Paster等研究结果相似,其原因可能是药物对细菌产生了某种非致死性损伤或药物在与细菌结合部位有一定的持久性。氟喹诺酮类药物(包括环丙沙星)一般是使DNA旋转酶功能失常。PAE代表了细菌酶功能失活状态到酶完全恢复功能所需时间。

3.3  菌利康MIC中环丙沙星含量小于纯环丙沙星,但是其PAE却较长,原因可能是白头翁、连翘、黄芩和柴胡亦是一类抗菌、解毒类中草药有关。现代研究表明,柴胡具有解热、镇痛、止咳、抗炎、预防消化道溃疡及抗菌抗病毒等作用,连翘也具有抗菌、消炎作用,对大肠杆菌、伤寒杆菌、肺炎杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、白喉杆菌及溶血杆菌等均有抑制作用,黄芩、白头翁具有抗菌等作用。环丙沙星具有抗菌谱广、抗菌活性强、细菌很少产生耐药性、体内分布广泛等优点,由二者复合而成的菌利康使二者具有了协同作用,从而使药物发挥出最佳药效,其作用机制有待于进一步探讨。

3.4  以往评价抗菌药物的药效学常用指标是最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC),故传统的给药方案设计要求血浆或组织药物浓度应维持在MIC以上。 而PAE的发现则为优化给药模式提供了新的理论依据。 研究发现,在PAE期间致病菌毒性降低,宿主免疫作用的敏感性增强,进一步增强了药物对于细菌的作用。 因此,临床上可将PAE与MIC、MBC及药效学参数相结合,为全面评价抗菌药物的药效学提供重要参考依据。 此外,将PAE与体外药敏试验结合,可以更准确的评价联合用药的合理性。

氟喹诺酮类药物的抑菌、杀菌作用在很大范围内呈剂量依赖性,且PAE较长。鉴于PAE的研究,对该类药物采取每日12次的给药方案是合理的。据PAE理论,间歇给药或大剂量少次给药(冲击疗法)同样能达到甚至优于持续多次给药的疗效,这为设计给药方案提供了新的重要参数,对有明显PAE的药物的最适给药间隔为血药浓度超过MIC的时间加上PAE的时间。这样,不仅使给药间隔延长,用药剂量减少,细菌产生的耐药性降低,还使其可能产生的不良反应减少。而且,大剂量用药还可以增强组织穿过力及感染组织中抗菌药物的浓度。从而提高疗效。同时,PAE的发现也降低了药物成本,减轻了病人的经济负担。且PAE研究的不断深入及其机理的阐明,将会进一步提高抗菌药物的治疗水平。

 

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