中华人民共和国农业部公告第2078号

发布: 2014-04-04 |  作者:  |   来源:

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  根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定,我部组织制定了口蹄疫灭活疫苗内毒素和总蛋白测定法,现予发布,自发布之日起执行。

  特此公告。

  附件:1.口蹄疫灭活疫苗内毒素测定法

  2.口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法

                                         农业部

                                        2014年3月12日

  附件1

口蹄疫灭活疫苗内毒素测定法

  吸取12 ml疫苗放入15 ml离心管中,置50Ⱶ℃水浴90分钟,然后在4℃条件下,以15000 g离心10分钟,取水相5.0 ml,按现行《中国兽药典》一部附录进行检验。每头份疫苗中内毒素含量应不高于50 EU。

  附件2

口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法

  取1瓶疫苗恢复至室温,在3个1.5ml离心管中分别精确加入100疫苗和900丙酮,充分混匀,室温放置10分钟,在4℃条件下,以15000g离心15分钟。吸弃液相,沉淀物用400丙酮洗涤2次,室温干燥约15分钟,加50去离子水复溶后,按附注进行检验。每毫升疫苗总蛋白含量应不高于500。

  附注:口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法

  1.方法与原理

  本法适用于口蹄疫病毒油佐剂灭活疫苗总蛋白含量检测。本法系福林酚法(lowry法),依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与C+螯合形成蛋白质-铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

  2.试剂与仪器

  2.1试剂丙酮(分析纯)、无菌去离子水、商品化Lowry法改良试剂盒;

  2.2设备酶标仪(全波长),“ݥ𞋹6孔板,卡介苗注射器,单通道和多通道移液器,涡旋震荡仪,酶标板振荡器等。

  3.操作步骤

  3.1标准系列稀释液制备将商品化试剂盒内标准牛血清白蛋白(2mg/ml母液),按下表依次稀释。

编号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

母液()

0

5

25

50

100

150

200

300

400

去离子水()

400

395

375

350

300

250

200

100

0

终浓度(/ml)

0

25

125

250

500

750

1000

1500

2000

  3.2检验疫苗处理取1瓶疫苗恢复至室温摇匀后,在3个1.5 ml离心管中分别精确加入100疫苗和900丙酮,充分混匀,室温放置10分钟,在4℃条件下,以15000 g离心15分钟。吸弃液相,沉淀物用400丙酮洗涤2次,室温干燥约15分钟,加50去离子水复溶备用。

  3.3反应板加样与读数

  3.3.1各取3.1稀释的各浓度牛血清白蛋白标准溶液40,以及三重复待检疫苗样品40,分别加入到96孔板内。用排枪迅速加入200改良lowry法试剂盒内试剂,立即用振荡器混匀30秒;

  3.3.2封膜,室温孵育10分钟;

  3.3.3各孔内分别加入20 1倍酚试剂(试剂盒内为2倍,用前用去离子水现稀释),立即用振荡器混匀30秒;

  3.3.4封膜,室温孵育30分钟;

  3.3.5酶标仪测定750nm吸光值,保存读数。

  3.4数据处理

  根据系列标准蛋白稀释液的浓度(0/ml~2000/ml)和750nm吸光值,使用EXCEL以吸光值为X轴,以蛋白标准浓度为Y轴,绘制标准曲线,依据趋势线求得多项式,其多项式R2≥0.98。

  将被检样品的吸光值代入标准蛋白获得的多项式,计算样品中蛋白含量,根据取样量求得1ml样品中蛋白含量。例如口蹄疫灭活疫苗水相/油相比例为1:1,免疫剂量为2ml时,100疫苗经丙酮沉淀后用50去离子水复溶,测得浓度即为每头份疫苗中蛋白浓度,或2ml疫苗中蛋白浓度。结果判定时,将测定值除以2即得每毫升疫苗中总蛋白含量。

  3.5结果判定

  若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量小于或等于500,则判定被检疫苗总蛋白含量符合规定;若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量大于500,判定被检疫苗总蛋白含量不符合规定。

  3.6检测数据处理举例

  3.6.1收集数据如表所示

Value

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

0.102

0.149

0.336

0.504

0.836

1.122

1.334

1.702

1.923

--

--

--

B

0.677

1.722

0.252

1.116

2.167

1.020

--

--

--

--

--

--

C

0.640

1.704

0.230

1.050

2.195

0.962

--

--

--

--

--

--

D

0.641

1.716

0.225

1.061

2.175

1.012

--

--

--

--

--

--

E

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

F

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

G

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

H

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

  上述表格中,A1-A9为系列稀释的标准牛血清白蛋白溶液,A1至A9蛋白浓度依次增高;B、C、D行中1-6列为检测样品750nm吸光值,B1-B6为6批不同批次疫苗样品,每一列为同一疫苗样品三个重复。

  3.6.2绘制标准曲线:将上表中数据复制到EXCELL表格中,

Value

1

2

3

4

5

6

7

8

9

OD750

0.102

0.149

0.336

0.504

0.836

1.122

1.334

1.702

1.923

蛋白浓度/ml

0

25

125

250

500

750

1000

1500

2000

  采用EXCEL程序,选中1-9列对应的两行数据→“插入”→“散点图”,选择“带平滑线和数据标记的散点图”,得到以750nm吸光值为X轴,以蛋白浓度为Y轴的曲线图。选择“图表工具”中“布局”→ “趋势线”→“其他趋势线选项”,选中“多项式”、“显示公式”和“显示R平方值”。通常R平方值大于等于0.98表明标准曲线可信。每一块96孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线。

  3.6.3数值计算

  以样品测定OD750值为X,代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423,Y为蛋白浓度,以表中第一批疫苗测定结果为例。该疫苗三重复测定的OD750数据(X)分别为:0.677、0.640、0.641,代入公式计算蛋白含量(Y)分别为:334/b>g/ml、306/b>g/ml、307/b>g/ml,该数据为每毫升水相抗原中总蛋白含量。计算三重复数值的平均值(AVERAGE)为316/b>g/ml,标准差(STDEV.P)为13.1,变异系数为4.15%(标准差/平均值*100%),将每毫升水相抗原中总蛋白含量,除以2折算为每毫升疫苗总蛋白含量,该疫苗的总蛋白含量为138/b>g/ml。按照上述方法,可计算其他样品的总蛋白含量。

  3.6.4结果判定

  同一样品不同重复间变异系数应小于5.3%,否则试验不成立,应重做。若测定值小于或等于500/ml,则判定被检疫苗总蛋白含量符合规定;若测定值大于500/ml,则判定被检疫苗总蛋白含量不符合规定。

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